之前寫過許多有關(guān)新冠核酸檢測試劑注冊相關(guān)文章，本文從科普角度，一方面為大眾介紹新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊產(chǎn)品，另一方面為已取得新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊證的生產(chǎn)企業(yè)，說說生產(chǎn)注意事項。

新冠核酸檢測試劑（熒光PCR法）注冊及生產(chǎn)注意事項：

1、概述

新型冠狀病毒(2019 -nCoV)是一種具有急性呼吸道傳染性的RNA病毒，其直徑在100 nm左右，有四種主要的結(jié)

構(gòu)蛋白:刺突蛋白(Spike protein, S蛋白)，核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein, M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein, E蛋白)。N蛋白在冠狀病毒中含量豐富，是一種高度免疫原性蛋白，參與基因組復(fù)制和細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)。目前已獲證的新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑主要針對的靶標(biāo)包括ORF1ab基因，E基因和N基因，其反應(yīng)原理以實時熒光PCR法為主流方法學(xué)。

新型冠狀病毒(2019-nCoV) 核酸檢測試劑(熒光PCR法)的基本原理是以新型冠狀病毒(2019-nCoV)的特異性基因(包括ORF1ab基因、E基因和N基因)設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，通過熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，從而實現(xiàn)對新型冠狀病毒(2019-nCoV) 核酸的檢測。臨床樣本核酸提取后，進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實時擴(kuò)增曲線。同時設(shè)置內(nèi)參照，主要對樣本采集、保存和運(yùn)輸以及核酸提取過程進(jìn)行監(jiān)控，避免假陰性結(jié)果的判。

2、產(chǎn)品組成(以某獲證產(chǎn)品為例)

通常由核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、酶混合液、PCR檢測混合液、陽性對照和陰性對照組成( 見圖2)。擴(kuò)增反應(yīng)液中一般包含鎂離子、核苷酸混合液等擴(kuò)增中必需的原料及緩沖液成分;酶混合液通常是各種酶的集合(如: DNA/RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、UNG酶等) ; PCR 檢測混合液包括針對不同基因以及內(nèi)參基因的引物/探針，根據(jù)不同企業(yè)設(shè)計驗證的結(jié)果，組分的名稱及具體成分可能略有差異，比如可能存在dNTPs等原料與引物/探針配制于同一管檢測液中的情況;陽性對照是含有特異性片段的病毒樣顆粒，陰性對照通常是生理鹽水或樣本保存液。

3、預(yù)期用途

主要用于體外定性檢測新型冠狀病毒肺炎疑似病例、其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者的鼻咽拭

子、口咽拭子、痰液樣本等中，新型冠狀病毒(2019-nCoV)的0RF1ab、N基因和E基因。部分企業(yè)已獲證產(chǎn)品只針對其

中某一種或兩種基因。有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案》、《新型冠狀病毒肺炎防控方案》 等文件執(zhí)行。在使用上應(yīng)當(dāng)遵守《新型冠狀病毒肺炎診療方案》、《新型冠狀病毒肺炎防控方案》等文件的相關(guān)要求。開展新型冠狀病毒核酸檢測，應(yīng)符合《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》等的要求，做好生物安全工作。最終的檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

4、規(guī)格型號

因體外診斷試劑產(chǎn)品的工藝特殊性，最終成品的規(guī)格區(qū)別通常在于分裝體積或檢測人份數(shù)的不同，如: 50人份/盒、

96人份/盒等。

5、產(chǎn)品性能(以某獲證產(chǎn)品為例)

5.1外觀

在自然光下以正常視力或矯正視力目視檢查,試劑盒各組分齊全，標(biāo)簽字跡清晰，說明書內(nèi)容完整、詳細(xì)，外包裝盒完整。澄清均一液體，無肉眼可見渾濁或不溶性雜質(zhì)。

5.2陽性參考品符合率

按試劑盒說明書要求檢測國家陽性參考品，應(yīng)符合相應(yīng)規(guī)定。或檢測企業(yè)制備的陽性參考品P1-P5，結(jié)果均為陽性。

5.3陰性參考品符合率

按試劑盒說明書要求檢測國家陰性參考品，應(yīng)均為陰性?；驒z測企業(yè)制備的陰性參考品N1-N12，結(jié)果均為陰性。

5.4精密度

按試劑盒說明書要求檢測國家精密性參考品, 10次檢測結(jié)果均為陽性，且Ct值的變異系數(shù)(CV, %)應(yīng)不高于5.0%?；驒z測企業(yè)參考品中的精密度參考品3份(J1、 J2和J3)，重復(fù)檢測10次,計算精密度參考品J1.J2檢測結(jié)果FAM/VIC(HEX)通道的Ct平均值x和標(biāo)準(zhǔn)偏差SD,按式(1)計算變異系數(shù)CV，結(jié)果應(yīng)不大于5. 0%; J3檢測10次結(jié)果均為陰性。

5.5最低檢出限

按試劑盒說明書要求檢測國家靈敏度參考品S，將其使用無RNA/DNA酶的去離子水進(jìn)行1:3倍比稀釋(2份水+1份樣本，后同)后，將1:9、1:27、1:81. 1:243、1:729、1:2187.1: 6561、1:19683、 1:59049、 1:177147 分別標(biāo)記為S1 ~S10,檢測結(jié)果S1^ S3應(yīng)為陽性?；虬丛噭┖姓f明書要求檢測企業(yè)參考品中的最低檢出限參考品1份(L)，重復(fù)檢測3次，結(jié)果均為陽性。

8、關(guān)鍵原材料及性能要求

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分(如有)、質(zhì)控品、參考品等。如主要原材料源于外購，供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)能提供其詳細(xì)制備過程。

8.1引物和探針

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實驗等。

8.2 dNTP

包括dATP、dGTP、 dCTP、 dTTP、 dUTP (如有)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括純度、濃度、功能性等。

8.3酶

需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(如有)等，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括對酶活性和功能性等的驗證。

8.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

8.5內(nèi)標(biāo)

又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。

8.6企業(yè)參考品

一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。企業(yè)參考品應(yīng)優(yōu)先采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。無法獲得臨床樣本或病毒培養(yǎng)物企業(yè)需說明其合理性。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括功能性檢測等。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。建議如下:

1)陽性參考品:著重考慮不同來源的病毒樣本和濃度要求，至少選取不同來源的5個病毒樣本。

2)陰性參考品:一般包括冠狀病毒(HKU1 .0C43、NL63、229E)、SARS冠狀病毒(可采用假病毒)、MERS冠狀病毒(可采用假病毒)、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。不適用的陰性參考品企業(yè)需說明其合理性。

3)檢出限參考品:可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。

4)重復(fù)性參考品:一般包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

9、質(zhì)量控制點(diǎn)

9.1 PCR檢測混合液的配制;

9.2核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的分裝(如有) ;

9.3酶混合液的分裝;

9.4 PCR檢測混合液的分裝;

9.5陰性對照的分裝;

9.6陽性對照的配制;

9.7陽性對照的分裝。

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