寨卡病毒核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則

（征求意見稿） 

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對寨卡病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則是供體外診斷試劑注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

寨卡病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，呈球形，直徑約為40-70nm，有包膜。基因組為單股正鏈RNA，長度約為10.8Kb，兩端為非編碼區(qū)，內(nèi)部的單一開放讀碼框依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，包括衣殼蛋白（C）、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）、包膜蛋白（E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），根據(jù)基因組序列不同分為亞洲型和非洲型兩個基因型。

寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、病毒抗原檢測、IgM和IgG抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離培養(yǎng)等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前主要采用病毒核酸檢測。核酸檢測主要采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光PCR、恒溫擴增等方法，檢測樣本類型包括血清、血漿、尿液、精液或唾液等。

本指導(dǎo)原則適用于采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光PCR法，對血清、血漿、尿液、精液或唾液等樣本中的寨卡病毒核酸進行體外定性檢測的試劑。

對于采用其他方法學(xué)的寨卡病毒核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價資料。

本指導(dǎo)原則適用于寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導(dǎo)原則針對寨卡病毒核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如寨卡病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提取（手工和自動提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產(chǎn)品進行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測的靶基因，需選擇保守性和特異性相對較高的基因，同時還應(yīng)考慮基因的擴增效率。檢測基因的選擇應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

如有適用國家標(biāo)準(zhǔn)品、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。

如申報產(chǎn)品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進行分析或驗證。

適用的不同樣本類型應(yīng)分別進行分析性能研究。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的寨卡病毒陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，提交具體的試驗資料。建議采用國際標(biāo)準(zhǔn)品建立校準(zhǔn)曲線的方法確定研究樣本的濃度。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒、假病毒或體外轉(zhuǎn)錄RNA等，進行分析性能評估。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應(yīng)相互獨立。

2.1樣本穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行詳細研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，滅活處理后的樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。

建議對每種樣本類型均進行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。

2.2適用的樣本類型

列表列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

對于血清和血漿樣本類型，可選擇有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的樣本進行樣本一致性的同源比對研究。研究樣本應(yīng)包含陰性、高值陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性等不同性質(zhì)和濃度水平。

如產(chǎn)品適用于其他樣本類型，應(yīng)對其他所有樣本類型進行全性能評估。

2.3企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數(shù)據(jù)。

2.4精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用臨床樣本或病毒培養(yǎng)物進行精密度評價，應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：不含待測物，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5包容性

2.5.1采用生物信息學(xué)方法對產(chǎn)品檢測的包容性進行研究，研究應(yīng)覆蓋已公布的寨卡病毒核酸序列。

2.5.2驗證具有時間和區(qū)域特征性的不同來源的陽性樣本，應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。樣本應(yīng)覆蓋已知寨卡病毒的主要型別，包含對亞洲型、非洲型和其他重點型別各不少于3個不同來源的陽性樣本（臨床樣本或病毒培養(yǎng)物）的研究。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

建議采用亞洲型和非洲型的流行株樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度重復(fù)檢測，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。申請人可采用半數(shù)組織感染量測定法（TCID50）的方法進行毒株濃度確認，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）的方式進行毒株濃度的確認，以PFU/mL作為毒株濃度的表示方式。除此之外，申請人還應(yīng)采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法進行毒株核酸濃度的確認，以copies/mL作為毒株濃度的表示方式。

2.6.2檢出限的驗證

選擇另外3例不同來源的寨卡病毒樣本在檢出限濃度水平進行驗證，應(yīng)達到95%陽性檢出率。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應(yīng)

需驗證相關(guān)病原體和多例人類基因組DNA（表1）的交叉反應(yīng)。建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病原體樣本的來源、陰陽性、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

對于某些難以培養(yǎng)或因為生物安全性無法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進行交叉驗證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗證的病原體核酸的來源、組成和濃度等信息，濃度可采用copies/mL單位表示。

表1 需進行交叉反應(yīng)驗證的物質(zhì)

注：*標(biāo)注為可采用生物信息學(xué)分析的方法進行研究的病原體。

2.7.2競爭性干擾

申請人應(yīng)充分考慮臨床上容易與寨卡病毒合并感染的病原體，如登革病毒等，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）寨卡病毒核酸檢測的影響，進行競爭性干擾研究。

2.7.3干擾試驗

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的寨卡病毒樣本。對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的Ct值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

表2 用于干擾試驗的物質(zhì)

2.8核酸（RNA）提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。

2.9反應(yīng)體系

2.9.1樣本采集和處理

2.9.1.1樣本采集方式的選擇

2.9.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

2.9.1.3樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，化學(xué)滅活部分應(yīng)對常見的消毒劑的適用性進行研究。研究樣本前處理方式，包括對不同樣本類型的離心條件的確定研究等。

2.9.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計分析結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對于開瓶穩(wěn)定性研究應(yīng)模擬真實使用情形，包括開瓶穩(wěn)定性的開瓶頻次和開瓶時間等。

4.陽性判斷值研究

陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進行陽性判斷值研究。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布寨卡病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的寨卡病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：應(yīng)著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來源的5個病毒樣本。

陰性參考品：主要涉及對交叉反應(yīng)的驗證情況，建議包括登革病毒（DENV-1～DENV-4）、西尼羅病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、基孔肯雅病毒、新型布尼亞病毒、漢坦病毒、漢城病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、丙型肝炎病毒 、EB病毒、人巨細胞病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、?？刹《?、細小病毒B19；立克次體、鉤端螺旋體 、瘧原蟲；傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌等。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價資料

該類試劑應(yīng)通過臨床試驗路徑進行臨床評價。臨床試驗應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗中應(yīng)關(guān)注的重點問題。

1.臨床試驗機構(gòu)

應(yīng)選擇具備相應(yīng)條件且按照規(guī)定備案的醫(yī)療器械臨床試驗機構(gòu)開展臨床試驗。寨卡病毒病屬于區(qū)域性傳染性疾病，建議申請人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域開展臨床試驗。臨床試驗機構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個試驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進行對比試驗，評價兩種檢測方法的一致性。同時還應(yīng)進行部分與寨卡病毒分離培養(yǎng)鑒定的對比試驗。以上兩方面評價結(jié)果結(jié)合起來共同論證試驗體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗資料中應(yīng)對測序方法進行詳細的介紹，并提交性能驗證數(shù)據(jù)，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗機構(gòu)委托第三方機構(gòu)/實驗室開展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機構(gòu)資質(zhì)和選擇依據(jù)。

2.1.2 如有已上市同類產(chǎn)品，臨床試驗亦可選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑的選擇應(yīng)考慮樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。

2.2 與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究

在上述比較研究的基礎(chǔ)上，申請人還應(yīng)采用試驗體外診斷試劑與寨卡病毒病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進行比較研究，評價試驗體外診斷試劑的臨床性能。寨卡病毒病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)可參考國家衛(wèi)健委發(fā)布的現(xiàn)行有效的寨卡病毒病診療方案推薦的確診依據(jù)。

3.臨床試驗受試人群的選擇

臨床試驗的受試人群應(yīng)來自產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為寨卡病毒感染的疑似病例，申請人在進行臨床試驗時應(yīng)依據(jù)國家衛(wèi)健委發(fā)布的現(xiàn)行有效的寨卡病毒病診療方案中對“疑似病例”的定義確定受試者入組標(biāo)準(zhǔn)。同時還應(yīng)入組部分需要進行鑒別診斷的登革熱等其他黃病毒感染患者，以及細小病毒感染、風(fēng)疹、麻疹、腸道病毒感染、立克次體病等患者，對臨床特異度進行充分評價。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期適用人群和寨卡病毒病發(fā)病特征，臨床試驗受試者中應(yīng)包含一定數(shù)量的孕婦和嬰幼兒受試者。此外臨床試驗應(yīng)納入部分弱陽性樣本。

4.臨床試驗樣本類型

寨卡病毒核酸檢測可能涉及的樣本類型包括血清、血漿、唾液、精液和尿液等。臨床樣本的采集建議按照國家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)實驗室檢測技術(shù)方案執(zhí)行。

如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，且經(jīng)分析和驗證不同樣本類型之間幾乎不存在差異，例血清和血漿樣本，則臨床試驗中不同樣本類型可進行匯總統(tǒng)計。如不同樣本類型在樣本基質(zhì)、干擾因素、被測物濃度水平等方面存在差異，例如血清/血漿與尿液、精液和唾液，則應(yīng)針對不同樣本類型分別進行臨床性能評價，包括分別進行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

臨床試驗陽性樣本和陰性樣本數(shù)量應(yīng)分別滿足統(tǒng)計學(xué)要求。針對與Sanger測序法或同類已上市產(chǎn)品的對比試驗，可采用目標(biāo)值法公式分別估算最低陽性和陰性樣本例數(shù)。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分數(shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。臨床試驗結(jié)果中，相關(guān)評價指標(biāo)的95%置信區(qū)間下限應(yīng)不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

與病毒分離培養(yǎng)鑒定的對比試驗亦應(yīng)入組一定數(shù)量的培養(yǎng)陽性及培養(yǎng)陰性病例，可采用抽樣精度的公式進行樣本量估算。

與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)對比的比較研究，建議參考與上述與對比方法對比的樣本量估算方法，設(shè)定合理的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。

6.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

臨床試驗結(jié)果一般以四格表的形式進行總結(jié)，并據(jù)此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽性/陰性符合率及其95%置信區(qū)間。

臨床試驗報告中應(yīng)對入組受試者的基本情況進行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等。特別應(yīng)針對用于特異性評價的各類受試者進行歸類匯總，確認入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類型，應(yīng)針對每種樣本類型分別進行統(tǒng)計分析（血清、血漿除外）。

臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉(zhuǎn)歸等信息進行充分的分析。臨床試驗結(jié)果應(yīng)能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要求。

7.境外臨床試驗數(shù)據(jù)的認可

境外臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結(jié)果影響的論證資料。

注冊申請人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床證據(jù)的形式要求

申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結(jié)、臨床試驗報告以及臨床試驗數(shù)據(jù)庫。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。寨卡病毒核酸檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

1．【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測寨卡病毒病疑似病例、其他需要進行寨卡病毒感染診斷或鑒別診斷者的XXX樣本（具體描述樣本類型）中的寨卡病毒RNA。

1.2有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照現(xiàn)行有效的《寨卡病毒病診療方案》及《寨卡病毒病防控方案》等文件執(zhí)行。

1.3簡單介紹寨卡病毒病病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現(xiàn)和現(xiàn)有診斷方法等。

1.4強調(diào)本試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

2.【檢驗原理】

簡述產(chǎn)品的核酸提取和RT-PCR原理。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進行簡要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。

4.【樣本要求】

4.1樣本的收集：分別明確推薦的不同樣本類型樣本的采集時間（如發(fā)病后7天內(nèi)）。需詳細描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，滅活方式，采樣體積，離心要求等。樣本的采集及處理方式若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。血漿樣本應(yīng)列明適用的抗凝劑類型。

4.2樣本的運送與保存：描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性、運送條件等。如聲稱樣本可以凍存，還應(yīng)明確凍融次數(shù)的限制。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質(zhì)控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍，作為試驗有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

6.【檢驗結(jié)果的解釋】

通過擴增曲線和Ct值進行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、復(fù)測、無效等所有情形。

7.【檢驗方法的局限性】

7.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

7.2有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析

7.2.1 如果樣本在運輸、處理過程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

7.2.2 試驗環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

7.2.3 試驗過程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

7.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運、儲存及處理、樣本中病原體含量過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.2該病原體待測靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.3 未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

簡述以下性能指標(biāo)：

8.1國家標(biāo)準(zhǔn)品和企業(yè)參考品的符合率。

8.2檢出限：簡要介紹評價方法、所用樣本情況以及評價結(jié)果。

8.3對包容性的研究情況進行總結(jié)。

8.4對精密度的研究情況進行總結(jié)。

8.5分析特異性

8.5.1交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗證的病原體種類，及有/無交叉反應(yīng)的濃度水平。

8.5.2干擾試驗：說明驗證的干擾物質(zhì)種類及有/無干擾反應(yīng)的濃度水平。

8.6臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結(jié)果和結(jié)論等。

9.【注意事項】

9.1臨床實驗室應(yīng)嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室要求、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范。

9.2 試驗操作人員應(yīng)接受過基因擴增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的試驗操作資格，實驗室應(yīng)符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》及其他涉及到傳染性病原微生物的管理規(guī)定中的相關(guān)要求。

9.2試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴格按照說明書操作。

9.3避免實驗室污染的措施

三、參考文獻

1.《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令第48號）[Z].

2.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號）[Z].

3. 中華人民共和國衛(wèi)生健康委員會. 寨卡病毒病診療方案（2016年第2版）[Z]. 2016-03-17.

4. 中華人民共和國衛(wèi)生健康委員會. 寨卡病毒病防控方案（第二版）[Z].2016-03-28.