2023年12月01日，國家藥監(jiān)局發(fā)布《ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（征求意見稿) 》，本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)醫(yī)療器械注冊申請人對ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用熒光PCR法、熔解曲線法等分子生物學(xué)檢測技術(shù)，對服用過和將要服用硝酸甘油進行治療的心絞痛患者靜脈全血或口腔拭子等樣本DNA中的ALDH2基因多態(tài)性進行體外定性檢測的試劑，用于硝酸甘油的用藥指導(dǎo)。通過對ALDH2*2（rs671，G1510A，Glu504Lys）多態(tài)性檢測，攜帶ALDH2*2等位基因的心絞痛患者盡可能改用其他急救藥物，避免硝酸甘油舌下含服無效。

本指導(dǎo)原則僅對用于硝酸甘油用藥指導(dǎo)的ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑的相關(guān)要求進行了說明，由于該基因還存在其他位點的多態(tài)性，且目前臨床意義不明確，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于其他分子生物學(xué)檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導(dǎo)原則針對相關(guān)產(chǎn)品注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中，產(chǎn)品描述應(yīng)詳述技術(shù)原理、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價、與同類和/或前代產(chǎn)品的比較等。與同類和/或前代產(chǎn)品的比較應(yīng)著重從技術(shù)原理、主要組成成分、預(yù)期用途、被測靶標(biāo)（基因多態(tài)性位點）、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況等方面詳細(xì)說明申報產(chǎn)品與已獲批準(zhǔn)的同類/前代產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。預(yù)期用途應(yīng)詳述基因多態(tài)性位點與臨床適應(yīng)證關(guān)系，明確野生型、雜合型以及純合型的發(fā)生率、易感人群等情況，特別是在中國人群的分布情況。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)相關(guān)文件資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

第三類體外診斷試劑應(yīng)當(dāng)提供三個不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗報告。目前已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求?？商峤簧暾埲顺鼍叩淖詸z報告或委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)出具的檢驗報告。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行的所有分析性能評估資料，包括具體試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析結(jié)果及結(jié)論等詳細(xì)資料。有關(guān)試驗的背景信息也應(yīng)在申報資料中進行描述，包括試驗地點，采用的試劑名稱、規(guī)格和批號，儀器名稱和型號，樣本的背景信息（來源、樣本編號、樣本類型、采集及處理方式、基因型和濃度確認(rèn)方法及結(jié)果）等。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別完成性能評估研究。

分析性能評估的試驗方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導(dǎo)原則進行，對于本類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性及適用的樣本類型

應(yīng)充分考慮樣本采集/處理、運輸、保存等各環(huán)節(jié)的影響，確定樣本的保存條件及保存時間并對樣本穩(wěn)定性進行充分驗證。如樣本提取后不立即進行檢測，則還需對提取后的DNA穩(wěn)定性進行充分研究。如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別進行樣本穩(wěn)定性研究。

對于全血樣本，如適用多種抗凝劑，建議通過同源比對研究對一定數(shù)量的臨床樣本驗證各種抗凝劑的適用性。

應(yīng)涵蓋檢測位點的野生型、純合型和雜合型樣本分別進行以上研究。

2.2質(zhì)控品的賦值

描述質(zhì)控品的賦值過程，并提交三批產(chǎn)品在不同適用機型上的賦值研究資料。

2.3準(zhǔn)確度

可通過申報產(chǎn)品與測序結(jié)果或已上市同類產(chǎn)品進行方法學(xué)比對研究，評價申報產(chǎn)品的準(zhǔn)確度；也可通過檢測參考品（盤）分析申報產(chǎn)品檢測結(jié)果與經(jīng)確認(rèn)結(jié)果的符合情況，評價申報產(chǎn)品的準(zhǔn)確度。

評價準(zhǔn)確度的樣本應(yīng)由若干份臨床樣本組成，樣本類型應(yīng)與產(chǎn)品適用范圍一致，樣本應(yīng)涵蓋所有檢測位點的野生型、雜合型和純合型，并包含不同濃度水平。

2.4精密度

精密度評價應(yīng)采用臨床樣本進行研究，樣本應(yīng)至少涵蓋所有多態(tài)性位點的雜合突變型。試驗操作應(yīng)按照說明書執(zhí)行，需包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。

精密度評價需滿足如下要求：

2.4.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次、試劑批次等。

2.4.2設(shè)定合理的精密度評價周期，并對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者間和不同實驗室間的精密度進行綜合評價。

2.4.3用于精密度評價的臨床樣本應(yīng)根據(jù)檢測范圍內(nèi)基因組DNA濃度至少設(shè)置檢出限附近濃度和中/高濃度水平。

2.4.4可結(jié)合產(chǎn)品的特點，對精密度指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如CV值。

2.5最低檢出限和檢測上限

2.5.1最低檢出限和檢測上限的建立

ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑的最低檢出限為：在滿足一定的檢測準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因的人基因組DNA最低濃度。

可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復(fù)檢測，確定95%檢出率水平下的人基因組DNA最低濃度，即為最低檢出限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測結(jié)果直接判定，也可通過適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和其他分析方法計算申報產(chǎn)品在設(shè)定概率下的檢出限，一般在該檢測濃度下應(yīng)具有95%的檢出率。

同時，申請人亦應(yīng)評價ALDH2基因多態(tài)性試劑可準(zhǔn)確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的人基因組DNA最高濃度。

應(yīng)采用臨床樣本進行檢出限及檢測上限研究，應(yīng)包含野生型、純合型、雜合型樣本。

2.5.2最低檢出限和檢測上限的驗證

選取與建立不同的臨床樣本對所有基因型進行驗證，建議對最低檢出限和檢測上限附近濃度水平的樣本進行至少20次的重復(fù)檢測，應(yīng)滿足95%以上檢出率要求。

2.6 分析特異性

2.6.1干擾研究

可通過在臨床樣本中添加干擾物質(zhì)的方式，評價添加前后干擾物質(zhì)對靶基因檢測的影響，亦可采用有代表性的患者樣本，通過對申報產(chǎn)品與不受該干擾物影響的測量方法檢測結(jié)果進行對比，進行干擾物質(zhì)研究。建議注冊申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

應(yīng)針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。對于全血樣本，內(nèi)源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、白蛋白等，外源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括抗凝劑、乙醇、乙醛、治療藥物等，對于治療藥物，建議選擇β受體阻滯劑、硝酸甘油、其他硝酸酯類藥物、鈣通道阻滯劑藥物、抗血小板藥物（如：阿司匹林、氯吡格雷或替格瑞洛）、調(diào)脂藥物（如：他汀類）等可能存在潛在干擾的藥物進行充分研究。對于口腔拭子樣本，干擾物需考慮血液、黏液、唾液以及口腔可能接觸到的抗菌漱口液、牙膏、食物、藥物（如：硝酸甘油、口腔噴霧劑）、煙草等。

2.6.2交叉反應(yīng)

應(yīng)對與靶基因序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變型的基因序列（如：ALDH1、ALDH5以及ALDH2基因中除檢測靶標(biāo)外的其他突變位點）進行交叉反應(yīng)研究。對于全血樣本，需提供血源性感染常見的病原體（如：乙肝、丙肝、HIV、梅毒）的交叉反應(yīng)研究；對于口腔拭子樣本，需補充常見的口腔定植菌以及上呼吸道感染病原體的交叉反應(yīng)研究。

試驗方案需明確交叉樣本的制備方法、核酸序列確認(rèn)方式及結(jié)果，并提交詳細(xì)的研究資料。

2.7核酸提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進行平行比對。

若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行精密度、檢出限和抗干擾的驗證。

2.8反應(yīng)體系研究

2.8.1樣本采集和處理

請詳述樣本的采集及處理方式，明確樣本的保存介質(zhì)。

對于口腔拭子樣本，還應(yīng)提供采樣拭子及樣本保存介質(zhì)（如：樣本保存液）的選擇研究，明確對拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求、保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗證檢出限和重復(fù)性。

2.8.2反應(yīng)體系

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性，提供反應(yīng)體系的確定研究資料。包括但不限于核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR反應(yīng)中樣本和試劑的加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)條件（如：溫度、時間、循環(huán)數(shù)）等。

如有多個適用機型，需提供不同適用機型基線和閾值的確定資料。不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、結(jié)果以及結(jié)論。

3.1實時穩(wěn)定性研究

提交至少三批申報產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。

3.2使用穩(wěn)定性

提交申報產(chǎn)品實際使用期間穩(wěn)定性的研究資料，應(yīng)包括所有組成成分的開封穩(wěn)定性。適用時提交復(fù)溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)研究資料等。明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。

3.3運輸穩(wěn)定性

提交申報產(chǎn)品可在特定或者預(yù)期的條件下運輸?shù)难芯抠Y料，應(yīng)說明產(chǎn)品正確運輸?shù)沫h(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機械保護等）。同時說明產(chǎn)品的包裝方式以及暴露的最差運輸條件。注意應(yīng)考察經(jīng)過運輸條件后實時穩(wěn)定性。

4.陽性判斷值研究

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準(zhǔn)確性的臨界值（Cut-off）。建議納入一定具有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床樣本，涵蓋野生型、純合和雜合突變型，采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進行陽性判斷值研究。相關(guān)資料中應(yīng)詳述試驗方案、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)、樣本背景信息（來源、唯一可溯源編號、性別、年齡、臨床診斷信息等）及試驗結(jié)果等。

應(yīng)針對不同樣本類型（如有）分別進行陽性判斷值研究，明確是否有差異。

如果試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇、來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供詳細(xì)的制備過程及支持性資料；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計原則，提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點的檢測靈敏度和特異性等進行評價，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。同時應(yīng)針對引物、探針及檢測靶序列與公開數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，如有同源序列應(yīng)著重評價是否會有交叉反應(yīng)。

申請人應(yīng)針對選定的引物、探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：外觀、分子量、純度、濃度、探針熒光標(biāo)記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性以及功能性試驗等資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.3酶：可能涉及到的酶包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性試驗等進行評價和驗證，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.4質(zhì)控品：ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑的質(zhì)控品可分別設(shè)置野生型、雜合型及純合突變型DNA樣品，同時設(shè)置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控；亦可直接采用待測位點的雜合型DNA樣品及空白質(zhì)控品進行質(zhì)量控制。

對于此類產(chǎn)品，一般情況下，反應(yīng)體系中野生型序列和突變型序列均有陽性反應(yīng)，可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，則試劑盒中可不另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對照；否則，應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對照。

質(zhì)控體系應(yīng)能夠?qū)z測全過程進行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用質(zhì)?；蚺R床樣本的核酸提取液等?？瞻踪|(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請人應(yīng)針對質(zhì)控品原料來源、選擇、制備、定值過程等提供詳細(xì)的研究資料，并對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.5 核酸提取/純化試劑（如有）：應(yīng)提供試劑的主要組成、原理介紹及相關(guān)的篩選及驗證資料。

5.1.6企業(yè)參考品：

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括準(zhǔn)確性參考品、特異性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、濃度及基因序列確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)研究資料。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

準(zhǔn)確性參考品：可采用臨床樣本進行設(shè)置，樣本類型與待測樣本一致。應(yīng)包含野生型、雜合型和純合突變型樣本，不同型別分別設(shè)置不同濃度。

特異性參考品：應(yīng)考慮檢測特異性的評價，適當(dāng)納入同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本等。

檢出限參考品：應(yīng)包含最低檢出限或略高于最低檢出限濃度臨床樣本，需覆蓋試劑盒聲稱的基因型。

精密度參考品：建議包括高、低兩個濃度水平，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。至少包含雜合型臨床樣本。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

該類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝研究資料主要包括工作液配制（引物探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。

生產(chǎn)過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制，可結(jié)合工藝流程圖描述生產(chǎn)工藝過程，明確關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。并提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價資料

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應(yīng)符合更新后的要求。

1.   臨床試驗機構(gòu)

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。臨床試驗機構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗方案。

2.臨床試驗方法

有已上市同類產(chǎn)品的，建議申請人選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用試驗體外診斷試劑與之進行對比試驗研究，評價申報產(chǎn)品的臨床性能。對比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認(rèn)其與申報產(chǎn)品具有較好的可比性。

如無已上市同類產(chǎn)品的，可以選擇公認(rèn)的參考方法（如Sanger測序法）作為對比方法。

3.受試者選擇和樣本類型

3.1受試者選擇

受試者應(yīng)為服用過和將要服用硝酸甘油進行治療的，具有心絞痛癥狀的冠心病、心力衰竭等疾病的患者。

3.2 樣本類型

適用的樣本類型一般為靜脈抗凝全血。如產(chǎn)品適用的不同樣本類型差異較大（如：靜脈抗凝全血、口腔拭子），建議分別按照臨床試驗設(shè)計與已上市同類產(chǎn)品或臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進行比對,也可按照同源比對的方式進行評價。

臨床試驗中應(yīng)為臨床原始樣本，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA進行試驗。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)同時滿足申報產(chǎn)品說明書以及對比試劑說明書（如適用）的相關(guān)要求。

4.臨床試驗樣本量

臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進行估算，同時應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗設(shè)計，本臨床試驗可依據(jù)申報產(chǎn)品相對于對比試劑的突變型、野生型符合率分別估算最低突變型、野生型樣本例數(shù)。

與對比方法進行的比較研究中，臨床樣本量的估算建議采用單組目標(biāo)值法進行計算，突變型/野生型符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%。當(dāng)評價指標(biāo)PT接近100%時，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

臨床試驗總體樣本量確定時應(yīng)在上述陽、陰性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量。應(yīng)注意雜合型和純合型基因型均應(yīng)有一定例數(shù)。

如申報產(chǎn)品適用于不同樣本類型（如：靜脈抗凝全血、口腔拭子），臨床試驗應(yīng)針對兩種樣本類型分別進行樣本量估算。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)對入組人群進行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。

總結(jié)野生型、雜合型和純合突變型的例數(shù)，以3×3表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，并分別計算各基因型的符合率、總體符合率及其95%置信區(qū)間，對定性結(jié)果進行kappa檢驗，以評價兩種試劑檢測結(jié)果的一致性。同時應(yīng)將雜合和純合匯總統(tǒng)計，并計算相應(yīng)的95%置信區(qū)間。

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進行復(fù)核，并對差異原因進行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)說明理由。

6.倫理學(xué)要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結(jié)果對受試者的風(fēng)險，提請倫理委員會審查，并獲得倫理委員會的同意。注冊申報時應(yīng)提交倫理委員會的審查意見。

7.臨床試驗方案

各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結(jié)果判定時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預(yù)試驗，以熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

9.臨床試驗報告撰寫

臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法，最后得出臨床試驗結(jié)論。臨床試驗報告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（五）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書的技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨注明文獻的相關(guān)信息。ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人體xx樣本中的xx基因位點的多態(tài)性。

1.2介紹被測靶標(biāo)（基因多態(tài)性位點），規(guī)范表述多態(tài)性位點，說明基因位點與臨床適用癥的關(guān)系，明確野生型、雜合型和純合型的臨床發(fā)生頻率，明確可進行硝酸甘油用藥指導(dǎo)的適用人群。

1.3明確本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者是否用藥的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標(biāo)等對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對試劑盒的被測靶標(biāo)進行詳細(xì)描述（基因位置、多態(tài)性位點及相關(guān)特征等），對試劑盒所用探針、引物、多態(tài)性的判定方式等進行詳細(xì)的介紹；對不同樣本反應(yīng)管組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

2.2如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理進行簡要介紹。

3.【樣本要求】

應(yīng)明確樣本采集、處理、保存等各環(huán)節(jié)要求，說明樣本保存條件及期限等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

4.【檢驗方法】

詳細(xì)說明試驗操作的各個步驟，包括：

4.1試驗條件：必要時，應(yīng)明確實驗室分區(qū)、試驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

4.2試劑配制方法和注意事項。

4.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理的質(zhì)量控制，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

4.4擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

4.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動化檢測程序及相關(guān)注意事項。

4.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對待測多態(tài)性及其他質(zhì)控品的熒光通道選擇等。

5.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合質(zhì)控品、樣本管檢測結(jié)果以及多態(tài)性類型與硝酸甘油表型之間的關(guān)系，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。

6.【檢驗方法的局限性】

6.1有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析。

6.1.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

6.1.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

7.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

7.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

7.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（六）質(zhì)量管理體系文件

申請人應(yīng)當(dāng)在申請醫(yī)療器械注冊時提交與產(chǎn)品研制、生產(chǎn)有關(guān)的質(zhì)量管理體系相關(guān)資料。詳述產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，提供生產(chǎn)工藝流程圖。明確申報產(chǎn)品反應(yīng)及檢測原理和過程，標(biāo)明主要控制點與項目及主要原材料、采購件的來源及質(zhì)量控制方法。

如適用，應(yīng)當(dāng)提供擬核查產(chǎn)品與既往已通過核查產(chǎn)品在生產(chǎn)條件、生產(chǎn)工藝等方面的對比說明。

三、參考文獻

[1] 藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南(試行)

[2]中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會,中華心血管病雜志編輯委員會.穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南[J].中華心血管病雜志,2018,46(9):680-694.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會,中華心血管病雜志編輯委員會.硝酸酯在心血管疾病中規(guī)范化應(yīng)用的專家共識[J].中華心血管病雜志,2010,38(9):770-774.